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Premio Nobel 2008 por el descubrimiento y desarollo de la "Green Flourescent Protein" (GFP) Realizado por: AARON NEBREDA TREJO  RAQUEL PANIAGUA MURILLO ANA PASCUAL NICOLAS PABLO PEÑALVER MENENDEZ 
 * Contenido ||  ||
 * 1. Introduccion ||
 * 2. Biografía de los premiados ||
 * 3. Historia ||
 * 4. Estructura ||
 * 5. Usos y aplicaciones ||
 * 6. Obtención y posterior modificación de la GFP ||
 * 7. Bibliografía y artículos de interés ||

Introducción   La proteína verde fluorescente (GFP) es una proteína compuesta por 238 aminoácidos (26.9kDa), que presenta fluorescencia de color verde brillante cuando es expuesta a la luz azul.Aunque muchos otros organismos marinos tienen similares proteínas, la GFP se refiere tradicionalmente a la primera proteína aislada de la medusa Aequorea victoria. La GFP de A. Victoria tiene un gran pico de excitación en una longitud de onda de 395 nm y uno menor a 475 nm. Su pico de emisión es de 509 nm, que se encuentra en la parte inferior verde del espectro visible. La GFP de la mariquita mar (reniformis Renilla) tiene un único pico de excitación en 498 nm. En biología celular y molecular, el gen GFP se utiliza con frecuencia como un portador de expresión. En formas modificadas se ha usado para hacer biosensores, y muchos animales han sido creados con este gen como prueba de que genes extraños pueden ser introducidos en organismos vivos. El gen GFP se puede introducir en los organismos y se puede mantener en su genoma a través de la cría, la inyección con un vector viral, o la transformación de la célula. Hasta la fecha, el gen GFP se ha introducido y se expresado en muchas bacterias, levaduras y otros hongos, peces (como el pez cebra), planta, moscas, y las células de mamíferos, incluidos los humanos. Martin Chalfie, Osamu Shimomura y Roger Y. Tsien fueron galardonados con el Premio Nobel 2008 de Química, el 10 de octubre de 2008 para su descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente.

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Biografía de los premiados



Osamu Shimomura



Nació el 27 de agosto de 1928 en Kyoto (Japón), pero fue educado en Manchuria y Osaka, donde su padre, oficial del ejércirto , estaba destinado. Posteriormente se trasladó a Isahaya, Nagasaki. En 1945, la bomba atómica que cayó sobre Nagasaki lo dejó temporalmente ciego. Osamu Shimomura cursó estudios de farmacia en Nagasaki y a partir de 1951 fue asistente en ese departamento por un periodo de cuatro años. En 1955 el joven investigador orientó su trabajo hacia la química orgánica. A partir de 1960 fue el primer científico en estudiar la luz que emitían las especies marinas. Una en concreto, la que desprendía la medusa 'Aequorea victoria' una medusa luminiscente que vive en el Pacífico Norte. Se cree que lo que despertó su interés por estudiar este tipo de especies marinas fue por su perdida de vista en la adolescencia. De un diámetro de cinco a diez centímetros, la 'Aequorea victoria' también es denominada 'gelatina de cristal' por su transparencia. Emite rayos verdes, probablemente tras recibir estímulos mecánicos como un contacto o los movimientos del agua. De esta manera, la medusa sólo deja ver un círculo luminosos visibles só luminoso muy fino, sólo visible por la noche. La longitud de onda “verde” podrían utilizarla como medio de defensa ante sus depredadores. Durante 20 años, a partir de 1967, Osamu Shimomura, pasó los veranos en el puerto de Friday Harbor, en el estado de Washington.

Tuvo que acumular una enorme masa de medusas para extraer pequeñas cantidades de la proteína fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP), cuyas propiedades provocaron en la investigación bioquímica un salto espectacular, y es ahora, uno de los instrumentos más importantes utilizados en la bioquímica moderna. Las proteínas fluorescentes, entre las cuales se encuentra la GFP, son muy versátiles y están siendo utilizadas en diversos campos como la microbiología, la ingeniería genética y en fisiología (las neurociencias), por ejemplo.

Gracias a esta proteína los investigadores han desarrollado formas de observar procesos que eran invisibles antes de su descubrimiento, como el desarrollo de las células nerviosas en el cerebro o la propagación del cáncer en las células. Los científicos pueden así seguir la evolución de varias células con la ayuda de la GFP, como las células nerviosas dañadas durante la enfermedad del Alzheimer o cómo se generan las células betas productoras de insulina en el páncreas de un embrión en crecimiento. En un experimento espectacular, los investigadores han conseguido identificar diferentes células nerviosas en el cerebro de un ratón con un caleidoscopio de colores. Gracia a este descubrimiento, Osamu Shimomura, a sus 80 años, recibió el Prem io Nobel de Química 2008, junto a otros dos investigadores norteamericanos ( Martin Chalfie y Roger Y. Tsien).

<span style="color: #5a00ff; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 20px;">Martin Chalfie <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">Uno de los galardonados con el premio Nobel de Química en 2008 fue el profesor de la Universidad de Columbia Martin Chalfie, Nacido en 1947 en Estados Unidos, criado en Chicago. Chalfie fue un alumno aventajado en Harvard (EEUU), donde se doctoro en Neurobiología en 1977. Su vida sigue vinculada a la universidad ya que es profesor de Facultad de Ciencias de la Universidad de Columbia (New York) desde 1982. Una vez doctorado, antes de comenzar a dar clases en la universidad, Chalfie pasó cinco años trabajando en un laboratorio en Inglaterra. El tiempo que pasó allí hizo de Martin un gran científico. En su laboratorio utiliza el nematodo //Caenorhabditis//// elegans // (//C. elegans//) para investigar el funcionamiento de las neuronas. Ha publicado más de 200 artículos, uno de los más influyentes fue //«The Neural Circuit for Touch Sensitivity in// C. Elegans», junto a John Sulston y Sydney Brenner en 1984. Fue a finales de los 80 cuando escuchó hablar por primera vez de la proteína verde de Shimomura, en un seminario organizado por su universidad sobre organismos bioluminiscentes. Su primer avance en la investigación fue colorear de forma aislada seis células de //Caenor-habditis elegans,// un minúsculo gusano transparente. Más tarde logró producir la GFP en la bacteria //Escherichia coli//, y en 1994, en las neuronas que controlan el tacto en el gusano "C. elegans". Así a sus 61 años, Martin Chalfie se ha convertido en el flamante ganador del premio Nobel de Química 2008 (junto a Shimomura y a Tsien) gracias sus experimentos que han logrado demostrar el valor de la proteína GFP luminosa para estudiar distintos fenómenos biológicos y su capacidad para iluminar las células.

​ Roger Y. Tsien Roger Y. Tsien nació el [|1 de febrero] de [|1952] en la ciudad de Nueva York, aunque creció en Livingston (New Jersey), rodeado de ingenieros. Su padre era ingeniero industrial y los hermanos de su madre eran profesores en el Instituto de Tecnología de Massachussets.. A la edad de 16 años, ganó el premio principal en un concurso de ámbito nacional llamado Búsqueda de Talento Westinghouse. Más tarde inició sus estudios universitarios en la Universidad de Harvard con una Beca Nacional de Mérito, graduándose en 1977, cuando tenía 20 años, con un grado en química y física. Como estudiante de postgrado en el Laboratorio de Fisiología de la Universidad de Cambridge, Tsien trabajó para desarrollar un colorante con el fin de seguir los niveles de calcio dentro de las células sin que éstas resultases dañadas. Trabajó como investigador en el [|Gonville and Caius College] hasta que en1981 asumió cátedra en la Universidad de California, Berkeley. A comienzos de los años 90, Tsien rediseñó la GFP para que emitiera colores que van del azul al amarillo y luego amplio esta gama de colores agregando una impresionante variedad de tonalidades, entre las que se encuentran variedades llamadas cereza, fresa, mandarina, tomate, naranja, plátano y ligamaza. También ha desarrollado una manera de supervisar las interacciones entre dos proteínas, cada una marcadas con distintos tonos de proteínas fluorescentes. Tsien, que sabe que otros científicos antes descubrieron y clonaron las proteínas fluorescentes, señala que “En general, las proteínas fluorescentes han tenido un impacto enorme en muchas áreas de las ciencias biológicas porque les dieron a (los científicos) una relación directa entre los genes y el ADN con algo que se puede ver dentro de una célula o en el interior de cualquier organismo”. Cuatro años después recibió el Premio de la Academia Heart Association de investigación básica y en 1998 se suma a la Academia de Ciencias de Estados Unidos. En 1989 ingresa como profesor en la Universidad de California, San Diego, puesto que mantiene hasta la actualidad. En 2008 gana el Premio Nobel de Química junto con otros dos científicos. La Academia le otorga el premio por “su contribución a nuestra comprensión general de cómo la GFP emite florescencia”. También fue reconocido con este galardón por su desarrollo de colorantes para seguir el movimiento del calcio dentro de las células y su creación de una amplia gama de colores fluorescentes, que científicos en todo el mundo utilizan estas proteínas fluorescentes multicolores para ver dónde y cuándo ciertos genes se expresan en las células o en organismos enteros. Tsien y su equipo siguen desarrollando aplicaciones biomédicas para la GPF y se han interesado por temas como el sistema inmune humano o la visualización y tratamiento del cáncer.

<span style="color: #993366; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 25px;">Historia <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"> La historia del descubrimiento se remonta a Japón, tras la II Guerra Mundial. En 1955, Shimomura fue contratado como ayudante en la Universidad de Nagoya y se le encomendó la tarea de describir qué compuesto hacia que los restos triturados de un molusco brillaran al contacto con el agua.

<span style="color: #008080; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"> <span style="color: #008080; display: block; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 25px; text-align: left;"> <span style="display: block; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px; text-align: left;">La primera descripción de un organismo bioluminiscente data de una fecha anterior a Cristo y se debe a Cayo Plinio Segundo el Viejo( 23-79 DC), quien describió en su " Historia Natural " la existencia de unas medusas en Nápoles que resplandecían con una tonalidad verdosa al ser expuestas a la luz solar.Plinio desarrolló una técnica para decorar cerámica empleando triturados de estos animales <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">Esta técnica utilizada, es la que se le encomendó a Osamu Shimomura para que estudiara. En 1956, concluyó que una proteína era la responsable de la luminiscencia, esto le valió el doctorado. Tras publicar sus resultados, prosiguió con sus estudios, pero esta vez más centrados en una especie en concreto, una medusa, la medusa Aequorea Victoria cuyo borde exterior brilla con luz verdosa cuando se agita. Shimomura descubrió que la causante de esta luminiscencia era una proteína, a la que denominó ( GFP). Tras pescar un gran número de estas medusas en la costa oeste de Norteamérica, en 1961, Shimomura consiguió aislar por primera vez la GFP de esta medusa mientras trabajaba en la Universidad de Princeton, cuando identificó la aequorina como sustancia activa de la bioluminiscencia de la medusa. Sin embargo, dudó de su hallazgo ya que la luz que emitía la aequorina era azul, por lo cual, dedujo que debía de haber involucrada una segunda proteína porque la fluorescencia de la medusa tiene la característica de ser verde. Allí. realmente, descubrió la GFP (Green Flourescent Protein), que flouresce de ese color cuando recibe la luz de la aequorina. Lo verdaderamente revolucionario de esta molécula esque no necesita aditivos para brillar, a diferencia de otras proteínas bioluminiscentes; basta con irradiarla con luz azul o ultravioleta. <span style="font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;">

Martín Chalfie, profesor de ciencias biológicas en la Columbia University de Nueva York, fue el pionero en el empleo de la GFP como etiqueta fluorescente dentro de los organismos vivos. Utilizó el GFP como rastreador de la actividad celular por primera vez en la bacteria, //Escherichia coli.// Manipuló genéticamente la GFP para crear proteínas de fusión en las cuales la GFP se enlazaba con otras proteínas que podían expresarse en otros organismos, tales como la bacteria //Escherichia coli// y la lombriz de tierra //Caenorhabditis elegans, de// modo que cuando estos se activaran, también lo hace el responsable de la GFP, lo que se observa por la emisión de luz verde. Para ello, tuvo que encontrar primero el gen que produce la GFP en la Aequorea victoria e incorporarla al genoma de la bacteria, de modo que ella misma pudiera producirla (para esto recurrió a [|Douglas Prasher] que había conseguido extraer el gen anteriormente). El experimento fue todo un éxito y lo que observaron al microscopio fue una bacteria luminosa de color verde al irradiarlo con luz UV. Poco después, utilizó este mismo procedimiento para visualizar los receptores neuronales de otro microorganismo, //Caenorhabditis elegans.// <span style="font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 12pt;">

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">El tercer afortunado de recibir el Premio Nobel, fue Roger Tsien, profesor de la Universidad de California en San Diego y su aportación al descubrimiento fue ampliar la “paleta de colores” y la intensidad con a que lucen las proteínas.



<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"><span style="font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 12pt;">Mostró cómo el cromóforo de la GFP adquiere su forma y estructura. Mediante ingeniería genética, construyó mutantes de la GFP que absorben y emiten luz en otras regiones del espectro creando toda una gama de proteínas fluorescentes ( que brillaban con más intensidad y en otros colores, por ejemplo, el azul marino, celeste o amarillo) que permiten el etiquetado de múltiples proteínas dentro de las células, como si se tratase de un arco iris.

<span style="font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 12pt;"> En fechas más recientes, se han generado numerosos animales transgénicos, desde ratones a cerdos pasando por conejos, gatos y peces, que expresan proteínas fluorescentes y un amplio abanico de aplicaciones en la investigación biomédica y biotecnología. Así, el marcaje con estas proteínas permite visualizar de forma no invasiva la evolución de tumores en animales de experimentación, simplemente observando la fluorescencia que emiten las células cancerosas al iluminar a los animales vivos con luz del color adecuado. La observación del crecimiento de bacterias patógenas, del desarrollo de circuitos neuronales o de la enfermedad de al­zhéimer, la detección de contaminación por metales pesados o la lucha contra la malaria son ejemplos de los muchos estu­dios que han visto luz verde gracias a la GFP<span style="font-family: 'Calibri','sans-serif'; font-size: 9.5pt; font-weight: normal;">.

Estructura de la GFP

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">La estructura de la proteína verde fluorescente (GFP) se determinó en 1996. Está constituida por 238 aminoácidos, que forman once laminas beta, cuyo conjunto forma un cilindro, en el centro del cual se encuentra una h<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">é lice alfa. Tiene una masa molecular de 27 kDa. La razón de que la GFP luzca con un color verde fluorescente es porque contiene un cromóforo especial, un grupo químico que absorbe y emite luz. Cuando la luz ultravioleta o azul incide sobre el cromóforo, éste absorbe energía de la luz y se excita. En la fase siguiente el cromóforo libera la energía y emite luz, verde en nuestro caso. La GFP posee dos picos de excitación: uno menor, a 475 nm, y uno mayor, a 395nm (luz azul). Su pico de emisión está a 509 nm, (luz verde). La estructura primaria está compuesta como se comenta anteriormente de una secuencia de 238 aminoácidos presentes en el siguiente cuadro siendo los aminoácidos subrayados los que forman el cromóforo.



<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">La fórmula del fluoróforo del GFP es 4‑hidroxibencilideno‑imidazolina‑5‑ona, y éste se encuentra unido al esqueleto peptídico a través de las posiciones 1- y 2- del anillo. Está formado por los residuos 65, 66, y 67 (Ser-Tyr-Gly).



<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">La estructura secundaria y terciaria está compuesta por once láminas ß antiparalelas y una hélice a  <span style="font-family: Symbol,sans-serif; font-size: 15px;"> <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">. Los cadenas forman un barril b de 40 Å, atravesado por la hélice a. El fluoróforo está sujeto a la hélice y sumergido en el centro del barril. Esta estructura, ha sido llamada // b -can// (literalmente lata- b ). Un gran número de grupos polares y moléculas de agua estructurada aparecen en el interior del barril, adyacentes al cromóforo, dándole estabilidad a éste.

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 10px;"> Estructura de GFP en la que se observan las once láminas en el barril b y el cilindro hueco central atravesado por una hélice a. El cromóforo (en gris en la izquierda y en naranja en la derecha) se encuentra en el centro del barril. <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 10pt;"> <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 10px;">

La GFP puede formar estructura cuaternaria por dimerizazión, asociándose dos cadenas de GFP, debido a que la concentración proteica influye en el espectro de excitación. En 1996, Tang estableció que esta proteína forma dímeros con //K//D= 1 x 10- 4 <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">M. La interfase de dimerización incluye residuos hidrofóbicos (Leu 206, Leu 221 y Phe 223) e hidrofílicos (Tyr 39, Glu 142, Ans 144, Ser 147, Asn 149, Tyr 151, Arg 168, Asn 170, Glu 172, Tyr 200, Ser 202, Gln 204 y Ser 208).

<span style="color: #800080; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 200%;">Usos y aplicaciones <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"><span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Tres hombres…Un descubrimiento. Un descubrimiento…Innumerables aplicaciones.

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">El descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente es una herramienta indispensable para la biología y la medicina moderna, ya que resulta esencial a la hora de visualizar cómo y cuando se expresan los genes. <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;"> Las proteínas que forman parte de un organismo vivo, controlan importantes procesos químicos a cada momento (Hay enzimas que controlan cuándo y dónde tiene lugar una determinada reacción en la célula; hay proteínas con función estructural y responsables de la integridad y los movimientos de la célula; hay proteínas encargadas del reconocimiento molecular y celular que nos permiten, por ejemplo, establecer comunicación entre las células que componen un órgano o la respuesta a estímulos extracelulares como neurotransmisores o neuronas; etc). Para comprender cómo funciona la célula es imprescindible poder conocer la localización de las proteínas implicadas en estos procesos y de qué forma interaccionan entre ellas, es decir, su papel dentro de la célula. Ya que además, si este mecanismo proteico falla, se producen enfermedades y dolencias. Hoy en día es posible conocer la naturaleza, los movimientos, las posiciones y las interacciones de las proteínas de un organismo gracias a la GFP, que actúa como un marcador brillante. Mediante el uso de las técnicas de recombinación de ADN, la proteína GFP puede unirse bioquímicamente a las proteínas del interior de la célula que queremos rastrear haciéndolas visibles, ya que emitirán luz verde fluorescente al contacto con luz azul o radiación ultravioleta (Conectaremos este indicador luminoso con otras proteínas a las que queremos “seguir la pista”). Esto es algo muy importante, puesto que debido a su diminuto tamaño, las proteínas no pueden verse directamente ni con el microscopio más potente. Pero al unirles GFP, conseguimos que se vuelvan fluorescentes. Poder comprender cómo funciona una maquinaria tan diminuta para nosotros como es la célula, es vital conocer de qué manera las células forman nuevos vasos que proporcionan oxígeno y nutrientes a un tumor, y así poder impedir su desarrollo… ( En este [|link] se puede apreciar cuán pequeña es una célula, mediante comparaciones)

El uso de la proteína GFP, permitió hacer visibles partes y procesos dentro de los organismos vivos que antes eran imposibles de observar, como el comportamiento de las neuronas en las personas, su desarrollo en el cerebro. La utilización de la GFP como marcador iba desde células individuales a organismos enteros.

<span style="color: #800080; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 150%;">



<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 120%;">Todo ello gracias a que Chalfie demostró que la GFP contenía un gen que podía insertarse en las proteínas que se quisieran estudiar. De este modo se podía dar color a las proteínas humanas o animales, lo que permitía a los expertos observar estas proteínas en un medio ambiente natural con ayuda de un macroscopio. Es decir, ya no había que sacrificar animales para entender la evolución, por ejemplo, de un tumor. Y he aquí la gran particularidad sobre la GFP, que no requiere, a diferencia de otras proteínas luminiscentes, ningún tipo de enzima o molécula para lograr que brille, lo que es una gran ventaja a la hora de <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 12pt;">trabajar con organismos vivos, puesto que no es necesario introducir ningún tipo de sustancia química adicional para poder estudiarlos. Como dijo Chalfie: “La proteína es importante porque proporciona una etiqueta hereditaria que permite el estudio no invasivo de las actividades celulares en tejidos y organismos vivos”. <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;"> <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 12pt;">Luego Tsien ayudó a mejorar el uso de la GFP ampliando la gama de colores con los que se podía marcar una proteína, lo que implicaba poder monitorear varios procesos biológicos al mismo tiempo. Desarrolló nuevas variantes de la GFP que brillaban con más intensidad y en otros colores, como el azul marino, celeste o amarillo. Otros investigadores han contribuido también con nuevos tonos. <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;"> ​ En un impresionante experimento al que los investigadores bautizaron como “brainbow”(de las palabras inglesas brain y rainbow) se usaron tres de estas proteínas: colorearon de rojo, azul-cyan y amarillo las diferentes células nerviosas del cerebro de ratones modificándolos genéticamente y el resultado fue un cerebro de ratón que brillaba con los colores del arco iris, ya que cada neurona fluorescía en un color determinado, ligera o totalmente distinto del de la neurona vecina, lo que permitía observar por primera vez la complejidad de todas los procesos neuronales simultáneamente.

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">Por este motivo es tan importante poder etiquetar a la vez a proteínas diferentes con colores distintos, porque nos permite también analizar dónde, cuándo y bajo qué estímulos interaccionan. En otro estudio, los investigadores crearon un ratón en el que hicieron fluorescentes, por medio de una GFP modificada, a las neuronas que conectaban los bigotes con el córtex. Gracias a que reemplazaron parte de su cráneo por una ventana de cristal, fueron capaces de observar la reprogramación que se producía en el cerebro del ratón cuando se le extirpaba la mitad de los bigotes. Esta ventana fluorescente al cerebro es una técnica que se utiliza para el estudio de los efectos del envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas.

Existen distintos tipos de usos para la GFP en función de si se expresa como tal en un determinado tipo celular o si se usa fusionada a otra proteína adjuntándose a la secuencia de amino ácidos de ésta. En el primer caso, actúa normalmente como un simple colorante vital que permite visualizar un subtipo celular en “vivo y en directo”. En el otro caso, nos permite además observar qué función y localización tiene la proteína a la que se ha unido. Es por esto que debemos recordar la enorme ventaja que supone el pequeño tamaño de la GFP y su compacta estructura, que permiten su unión (generalmente al extremo carboxilo-terminal) con la proteína que se quiere estudiar sin que se vea modificada significativamente ni la función ni la localización subcelular nativa de esta última. También podemos clasificar sus aplicaciones dependiendo de si se expresa GFP(o una de sus variantes) simplemente para localizar su presencia o si se emplean formas modificadas que fluorescen de diferente manera o son más o menos estables según el momento metabólico de la célula. Esta última aplicación es muy utilizada en biotecnología puesto que aquí la GFP actúa como un indicador funcional. Así, se han desarrollado bacterias resistentes al arsénico que brillan en presencia de éste metal, o de metales pesados como el cadmio y el zinc, e incluso del explosivo TNT. Estas bacterias resultan ser muy útiles ya que son una forma rápida y económica de comprobar la potabilidad de las aguas, por ejemplo, en pozos del Sudeste Asiático donde la contaminación es un problema frecuente. Sea como sea, todo empieza por transferir la secuencia de ADN que codifica para la proteína fluorescente a los organismos que se quieren rastrear. Esto se consigue mediante técnicas de transfección y/o de generación de animales y plantas transgénicas. Si hablamos de transgénesis, la expresión puede darse en unos tipos celulares o en otros dependiendo de la secuencia promotora que se emplee. Llamamos promotor a la secuencia de ADN genómico a la que se una la enzima RNA polimerasa para iniciar la transcripción. Esta región puede ser reconocida por diferentes factores de transcripción, lo que hace que ese ARN mensajero que se transcribe se exprese en determinados tipos celulares y en otros no, y que incluso de exprese en menos y mayor medida según el momento fisiológico de la célula. En el campo de la investigación de los transplantes de células (incluidas células madre) lo que se busca es poder cuantificar el grado de implantación y colonización de las células exógenas dentro del huésped y de los subtipos celulares que se originan. Para experimentos de transplantes se emplean ratones transgénicos que expresan <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;"> GFP <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">bajo el control de un promotor que se expresa en todo tipo celular y en todo momento de la vida de la célula. <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;"> <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">En estos ratones receptores es fácil distinguir tanto en la sangre como en los órganos sólidos las células exógenas gracias a esta proteína brillante. Expresar GFP unida a otra proteína nos da información tanto de los tipos celulares que expresan la proteína como de la localización subcelular de la proteína que pretendemos estudiar. Esto resulta especialmente apropiado cuando se trabaja con modelos animales de enfermedades por expresión "fuera de lugar" de una proteína patógena, como es el caso de la enfermedad de Huntington, ya que podemos monitorizar el nivel de expresión de la proteína patógena en los diferentes tejidos a lo largo de la vida del animal así como la localización subcelular de los agregados proteicos aberrantes. <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;"> Asimismo, los investigadores también pueden seguir la evolución de las células dañadas durante la enfermedad de Alzheimer mediante animales de experimentación, pueden ver cómo las células-β(productoras de insulina) se crean en el páncreas de un embrión en crecimiento o pueden usar la GFP para mostrar cómo viaja el VIH desde las células infectadas a las sanas. Incluso la GFP es de gran ayuda en la lucha contra la malaria. Por otra parte también se emplea GFP en la investigación sobre el cáncer,para marcar las proteínas de las células cancerosas que queremos rastrear. Los tumores que se formarán y que serán fluorescentes pueden ser implantados en ratones. Cuando las células cancerosas se rompen e inician metástasis, o se van moviendo por el cuerpo, continúan brillando, por lo que los científicos pueden ser testigos del avance de esta enfermedad. La proteína verde fluorescente tiene otras muchas aplicaciones en las que es posible observar justamente la proteína que queremos estudiar (de las miles y miles que se encuentran en una célula), monitorizando procesos fundamentales que tienen lugar en la célula tales como la división celular, la expresión genética, la replicación cromosómica, la transducción de señales, etc. <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Además la GFP puede ser empleada para la separación y purificación de proteínas. Recientemente se han generado numerosos animales transgénicos(cerdos, conejos, gatos y peces…) que expresan proteínas fluorescentes y se destinan como animales exóticos de compañía.

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">//**Cerdo verde transgénico**// Hoy en día los usos de la GFP y otras proteínas luminiscentes no son sólo médicos y biotecnológicos, también son la base de muchas aplicaciones industriales. La GFP y sus derivados tienen, por tanto, incontables aplicaciones y resulta casi imposible nombrarlas todas. Pero lo que está claro es que esta proteína verde fluorescente ha revolucionado la investigación con células madre, transplantes de órganos, neurociencia y cualquier cosa intermedia entre estos campos.

Obtencion y posterior modificacion de la GFP

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"> Una vez fue descubierta la proteína se sucedieron gran cantidad de estudios para conseguir saber cuales son las propiedades de esta proteína (espectros de emisión, mecanismos de excitación de la proteína para obtener el color, cual es el cromóforo…) Pero el avance mas importante lo realizo Prasher al conseguir obtener el gen que sintetiza la proteína y así abrir la puerta para la síntesis artificial de la proteína y sus futuros múltiples usos pudiéndose integrar en otros códigos genéticos y asi conseguir una amplia variedad de proteínas coloreadas con GFP (Inouye&Tsuji <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 10pt;">) <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">. El descubrimiento del gen que codifica esta proteína también permitió la posterior modificación de la proteína. Respecto a la modificación de la proteína se han conseguido avances bastante variados como:

> De todos estos se elijió el Ser65 -> Thr por tener el mayor pico de fluorescencia a 488nm. Esta proteina tambíen tenía la particularidad de que se oxida a mayor velocidad y produce fluorescencia mas rápidamente[|(1)]
 * En 1995 de forma fortuita durante un experimento con la proteina en el que se muto la proteína por debajo de la serina 65 para obtener un aminoácido diferente (Ala, Leu, Cys y Thr)Se conseguieron cuatro mutantes diferentes de la proteína, todos ellos habían eliminado la emisíon a 396 y habian incrementado la emision entre 470 y 490.



 <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">
 * Se ha cambiado el color de la fluorescencia, consiguiendo varias variantes como: “blueFP” “cyanFP” o yellowFP”.Estas "Familias" de proteinas modificadas tienen diferentes modificaciones en función del color que se quiera obtener[|(2)] Algunas de estas mutaciones requieren una modificación para devolver el brillo al cromóforo



<span style="color: #008080; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 20px;">​ A continuación copio una tabla con las diferentes familias de proteinas florescentes obtenidas: (Acronym)** ||~ **Excitation Maximum (nm)** ||~ **Emission Maximum (nm)** ||~ **Molar Extinction Coefficient** ||~ **Quantum Yield** ||~ **//in vivo// Structure** ||~ **Relative Brightness (% of EGFP)** ||  <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"> <span style="-moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; background: white;">
 * ~ **Protein
 * **GFP (wt)** || **395/475** || **509** || **21,000** || **0.77** || **Monomer*** || **48** ||
 * **Green Fluorescent Proteins** ||
 * **EGFP** || **484** || **507** || **56,000** || **0.60** || **Monomer*** || **100** ||
 * **Emerald** || **487** || **509** || **57,500** || **0.68** || **Monomer*** || **116** ||
 * **Superfolder GFP** || **485** || **510** || **83,300** || **0.65** || **Monomer*** || **160** ||
 * **Azami Green** || **492** || **505** || **55,000** || **0.74** || **Monomer** || **121** ||
 * **mWasabi** || **493** || **509** || **70,000** || **0.80** || **Monomer** || **167** ||
 * **TagGFP** || **482** || **505** || **58,200** || **0.59** || **Monomer*** || **110** ||
 * **TurboGFP** || **482** || **502** || **70,000** || **0.53** || **Dimer** || **102** ||
 * **AcGFP** || **480** || **505** || **50,000** || **0.55** || **Monomer*** || **82** ||
 * **ZsGreen** || **493** || **505** || **43,000** || **0.91** || **Tetramer** || **117** ||
 * **T-Sapphire** || **399** || **511** || **44,000** || **0.60** || **Monomer*** || **79** ||
 * **Blue Fluorescent Proteins** ||
 * **EBFP** || **383** || **445** || **29,000** || **0.31** || **Monomer*** || **27** ||
 * **EBFP2** || **383** || **448** || **32,000** || **0.56** || **Monomer*** || **53** ||
 * **Azurite** || **384** || **450** || **26,200** || **0.55** || **Monomer*** || **43** ||
 * **mTagBFP** || **399** || **456** || **52,000** || **0.63** || **Monomer** || **98** ||
 * **Cyan Fluorescent Proteins** ||
 * **ECFP** || **439** || **476** || **32,500** || **0.40** || **Monomer*** || **39** ||
 * **mECFP** || **433** || **475** || **32,500** || **0.40** || **Monomer** || **39** ||
 * **Cerulean** || **433** || **475** || **43,000** || **0.62** || **Monomer*** || **79** ||
 * **CyPet** || **435** || **477** || **35,000** || **0.51** || **Monomer*** || **53** ||
 * **AmCyan1** || **458** || **489** || **44,000** || **0.24** || **Tetramer** || **31** ||
 * **Midori-Ishi Cyan** || **472** || **495** || **27,300** || **0.90** || **Dimer** || **73** ||
 * **TagCFP** || **458** || **480** || **37,000** || **0.57** || **Monomer** || **63** ||
 * **mTFP1 (Teal)** || **462** || **492** || **64,000** || **0.85** || **Monomer** || **162** ||
 * **Yellow Fluorescent Proteins** ||
 * **EYFP** || **514** || **527** || **83,400** || **0.61** || **Monomer*** || **151** ||
 * **Topaz** || **514** || **527** || **94,500** || **0.60** || **Monomer*** || **169** ||
 * **Venus** || **515** || **528** || **92,200** || **0.57** || **Monomer*** || **156** ||
 * **mCitrine** || **516** || **529** || **77,000** || **0.76** || **Monomer** || **174** ||
 * **YPet** || **517** || **530** || **104,000** || **0.77** || **Monomer*** || **238** ||
 * **TagYFP** || **508** || **524** || **64,000** || **0.60** || **Monomer** || **118** ||
 * **PhiYFP** || **525** || **537** || **124,000** || **0.39** || **Monomer*** || **144** ||
 * **ZsYellow1** || **529** || **539** || **20,200** || **0.42** || **Tetramer** || **25** ||
 * **mBanana** || **540** || **553** || **6,000** || **0.7** || **Monomer** || **13** ||
 * **Orange Fluorescent Proteins** ||
 * **Kusabira Orange** || **548** || **559** || **51,600** || **0.60** || **Monomer** || **92** ||
 * **Kusabira Orange2** || **551** || **565** || **63,800** || **0.62** || **Monomer** || **118** ||
 * **mOrange** || **548** || **562** || **71,000** || **0.69** || **Monomer** || **146** ||
 * **mOrange2** || **549** || **565** || **58,000** || **0.60** || **Monomer** || **104** ||
 * **dTomato** || **554** || **581** || **69,000** || **0.69** || **Dimer** || **142** ||
 * **dTomato-Tandem** || **554** || **581** || **138,000** || **0.69** || **Monomer** || **283** ||
 * **TagRFP** || **555** || **584** || **100,000** || **0.48** || **Monomer** || **142** ||
 * **TagRFP-T** || **555** || **584** || **81,000** || **0.41** || **Monomer** || **99** ||
 * **DsRed** || **558** || **583** || **75,000** || **0.79** || **Tetramer** || **176** ||
 * **DsRed2** || **563** || **582** || **43,800** || **0.55** || **Tetramer** || **72** ||
 * **DsRed-Express (T1)** || **555** || **584** || **38,000** || **0.51** || **Tetramer** || **58** ||
 * **DsRed-Monomer** || **556** || **586** || **35,000** || **0.10** || **Monomer** || **10** ||
 * **mTangerine** || **568** || **585** || **38,000** || **0.30** || **Monomer** || **34** ||
 * **Red Fluorescent Proteins** ||
 * **mRuby** || **558** || **605** || **112,000** || **0.35** || **Monomer** || **117** ||
 * **mApple** || **568** || **592** || **75,000** || **0.49** || **Monomer** || **109** ||
 * **mStrawberry** || **574** || **596** || **90,000** || **0.29** || **Monomer** || **78** ||
 * **AsRed2** || **576** || **592** || **56,200** || **0.05** || **Tetramer** || **8** ||
 * **mRFP1** || **584** || **607** || **50,000** || **0.25** || **Monomer** || **37** ||
 * **JRed** || **584** || **610** || **44,000** || **0.20** || **Dimer** || **26** ||
 * **mCherry** || **587** || **610** || **72,000** || **0.22** || **Monomer** || **47** ||
 * **HcRed1** || **588** || **618** || **20,000** || **0.015** || **Dimer** || **1** ||
 * **mRaspberry** || **598** || **625** || **86,000** || **0.15** || **Monomer** || **38** ||
 * **dKeima-Tandem** || **440** || **620** || **28,800** || **0.24** || **Monomer** || **21** ||
 * **HcRed-Tandem** || **590** || **637** || **160,000** || **0.04** || **Monomer** || **19** ||
 * **mPlum** || **590** || **649** || **41,000** || **0.10** || **Monomer** || **12** ||
 * **AQ143** || **595** || **655** || **90,000** || **0.04** || **Tetramer** || **11** ||
 * *** Weak Dimer** ||
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"> <span style="-moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; background: white;">Otra mutación de gran utilidad a sido la manipulación de la proteína para hacerla sensible a los cambios de pH [|(3)], con esta modificación se a aprovechado para su uso en vesículas sinápticas consiguiendo la visualización de la actividad sináptica en neuronas

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"> <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">Este último cambio es problemático ya que desestabiliza el nucleo de la proteína; aun no se a conseguido solucionar este problema <span style="-moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; background: white;">
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;"> <span style="-moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; background: white;">Se ha conseguido manipular la GFP para que sea sensible a cambios redox [|(4)], esta proteina manipulada se conoce como RoGFP y es utilizada como biosensor ( instrumento para la medición de parámetros biológicos o químicos. Suele combinar un componente de naturaleza biológica y otro físico-químico)
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 15px;">Tambien se ha variado geneticamente el rango de temperatura en el que la proteina es funcional, se ha aumentado el empaquetamiento de la proteina y se a conseguido aumentar la solubilidad de la proteina.

Bibliografía y artículos de interes

[] [] [] [] http://www.bcm.edu/cain_foundation/noframes/html/pages/staff/robert_mcneil.htm http://tsienlab.ucsd.edu/Publications/Heim%201995%20Nature%20-%20Improved%20GFP.PDF http://www.beanm.com/publications/pHGFPpaper.pdf http://tsmb08.cryst.bbk.ac.uk/notice/course/demoproject/bridges/GFP/roGFP.htm [] [] [] [] [] [|www.analesranf.com/index.php/aranf/article/viewPDFInterstitial/925/908] [] [] [] [] []

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<span style="color: #008080; font-family: Arial,Helvetica,sans-serif; font-size: 20px;">​ ​